۲-۱-۳-۷٫ فعاليت ضد سرطاني ليپو پلي ساکاريد۲۵
۲-۲٫ سالمونلا۲۸
۲-۲-۱٫ پاسخ ايمني ميزبان به عفونت سالمونلايي۲۹
۲-۲-۱-۱٫ پاسخ ايمني ذاتي عليه سالمونلا۲۹
۲-۲-۱-۲٫ پاسخ ايمني اکتسابي عليه سالمونلا۳۰
۲-۲-۱-۳٫ سايتوکاين‌ها و کموکاين‌هاي دخيل در عفونت سالمونلايي۳۰
۲-۳٫ التهاب۳۱
۲-۳-۱٫ ويژگي‌هاي التهاب۳۱
۲-۳-۲٫ ميانجي‌هاي التهاب۳۲
۲-۴٫ ليپو پلي ساکاريد و التهاب۳۳
۲-۵٫ سيکلو اکسيژناز۳۴
۲-۵-۱٫ تاريخچه ي سيکلو اکسيژناز۳۵
۲-۵-۲٫ ساختار پروتئيني سيکلو اکسيژناز۳۵
۲-۵-۳٫ سيکلو اکسيژناز‌ها و سنتز پروستانوئيد‌ها۳۶
۲-۵-۴٫ اعمال پروستاگلاندين‌ها۳۷
۲-۵-۵٫ بيولوژي سيکلو اکسيژناز۳۷
۲-۵-۶٫ فيبروبلاست و سيکلو اکسيژناز۳۸
۲-۵-۷٫ نقش سيکلو اکسيژناز-۲ در آنژيوژنز۳۹
۲-۵-۸٫ سيکلو اکسيژناز و ليپو پلي ساکاريد۴۰
۲-۶٫ هيدروژن پر اکسيد۴۳
۲-۶-۱٫ تاريخچه‌ي هيدروژن پر اکسيد۴۳
۲-۶-۲٫ بيولوژي هيدروژن پر اکسيد۴۴
۲-۶-۳٫ گونه‌هاي واکنشگر اکسيژن۴۵
۲-۶-۴٫ ROS و منابع توليد آن۴۶
۲-۶-۵٫ سيستم اکسيداسيون- احيا و تکثير سلولي۴۷
۲-۶-۷٫ ردوکس و تمايز سلول‌هاي بنيادي۴۹
۲-۶-۸٫ ردوکس و تمايز سلول بنيادين جنيني به سلول‌هاي ماهيچه صاف (SMC)50
2-7. نيتريک اکسيد۵۱
۲-۷-۱٫ سنتز نيتريک اکسيد۵۲
۲-۷-۲٫ عملکرد NOS53
2-7-3. نقش‌هاي فيزيولوژيکي NO53
2-7-4. اثر NO بر رگ‌هاي خوني۵۳
۲-۷-۵٫ نقش NO در سيستم ايمني۵۴
۲-۷-۶٫ نقش NO در التهاب۵۴
۲-۷-۷٫ نقش NO در سيستم عصبي۵۵
۲-۷-۸٫ NO و مرگ تدريجي سلول۵۵
۲-۷-۹٫ نقش iNOS در القاي COX-255
2-7-10. نقش iNOS در تکثير۵۶
۲-۸٫ پوست۵۷
۲-۸-۱٫ فيبروبلاست۵۸
۲-۹٫ زخم۶۱
۲-۹-۱٫ چگونگي ترميم زخم طي روز‌هاي مختلف۶۱
۲-۹-۱-۱٫ ۲۴ ساعت اول۶۱
۲-۹-۱-۲٫ روز سوم۶۲
۲-۹-۱-۳٫ روز پنجم۶۲
۲-۹-۱-۴٫ هفته‌ي دوم۶۲
۲-۹-۱-۵٫ اواخر ماه اول۶۲
۲-۹-۲٫ مراحل ترميم زخم۶۳
۲-۹-۲-۱٫ مرحله‌ي التهابي۶۳
۲-۹-۲-۱-۱٫ ميانجي‌هاي شيميايي التهاب۶۷
۲-۹-۲-۱-۲٫ پروستاگلاندين‌ها و لوکوترين‌ها۶۷
۲-۹-۲-۲٫ مرحله‌ي تکثير۶۷
۲-۹-۲-۲-۱٫ ري اپيتلياليزاسيون۶۸
۲-۹-۲-۲-۲٫ فيبروپلازيا۶۸
۲-۹-۲-۲-۳٫ آنژيوژنز۶۹
۲-۹-۲-۳٫ مرحله‌ي بازسازي۶۹
۲-۹-۳٫ اهميت ماکروفاژ‌ها در التيام زخم۶۹
۲-۹-۳-۱٫ فنوتيپ ماکروفاژ‌هاي زخم۷۰
۲-۹-۳-۲٫ اثر ماکروفاژ‌ها بر فيبروبلاست‌ها و ميو فيبروبلاست‌ها۷۱
۲-۹-۳-۳٫ ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ي التهاب۷۲
۲-۹-۴٫ زخم و هيدروژن پراکسيد۷۳
۲-۹-۴-۱٫ اثرات مثبت استرس اکسيداتيو در التيام زخم۷۷
۲-۹-۴-۱-۱٫ انعقاد۷۷
۲-۹-۴-۱-۲٫ آغاز و دوام فاز التهابي۷۸
۲-۹-۴-۱-۳٫ ري اپيتلياليزاسيون۷۸
۲-۹-۴-۱-۴٫ آنژيوژنز و رسوب ماتريکس۷۹
۲-۹-۴-۲٫ اثر منفي استرس اکسيداتيو و استرس نيترو اکسيداتيو در ترميم زخم۸۰
۲-۹-۵٫ نيتريک اکسيد و زخم۸۲
۲-۹-۵-۱٫ اثر مثبت نيتريک اکسيد در ترميم زخم۸۲
۲-۹-۵-۱-۱٫ التهاب۸۳
۲-۹-۵-۱-۲٫ آنژيوژنز۸۳
۲-۹-۵-۱-۳٫ ري اپيتلياليزاسيون۸۳
۲-۹-۵-۱-۴٫ رسوب ماتريکس و بازسازي۸۴
۲-۹-۵-۲٫ کاربرد نيتريک اکسيد در درمان زخم۸۵
فصل سوم: مواد و روش‌ها
۳-۱٫ مواد و وسايل و دستگاه‌هاي بکار رفته در آزمايش۸۹
۳-۲٫ طرز تهيه‌ي محلول‌ها و معرف‌هاي بکار رفته۹۱
۳-۲-۱٫ محيط کشت DMEM91
3-2-2. FBS91
3-2-3. بافر PBS91
3-3. کشت سلول‌هاي فيبروبلاست۹۱
۳-۴٫ آماده‌سازي غلظت‌هاي مختلف ليپو پلي ساکاريد۹۲
۳-۵٫ تيمار ليپو پلي ساکاريدي فيبروبلاست‌ها۹۳
۳-۶٫ رنگ‌آميزي XTT93
3-7. رنگ‌آميزي تريپان بلو۹۵
۳-۸٫ شمارش سلولي۹۵
۳-۹٫ تعيين درصد زنده ماندن سلول‌ها۹۵
۳-۱۰٫ تعيين ميزان نيتريک اکسيد در نمونه‌ي ليز شده سلولي۹۶
۳-۱۰-۱٫ آماده سازي نمونه‌ها۹۶
۳-۱۰-۲٫ روش کار۹۶
۳-۱۱٫ تعيين ميزان هيدروژن پر اکسيد در نمونه‌ي ليز شده سلولي۹۷
۳-۱۱-۱٫ آماده‌سازي نمونه‌ها۹۷
۳-۱۱-۲٫ منحني استاندارد H2O298
3-11-3. مخلوط واکنش۹۸
۳-۱۲٫ اندازه‌گيري سطح آنزيم COX-2 در نمونه ليز شده سلولي۹۸
۳-۱۲-۱٫ مواد۹۹
۳-۱۲-۲٫ آماده‌سازي محلول‌ها۹۹
۳-۱۲-۳٫ آماده‌سازي نمونه‌ها۹۹
۳-۱۲-۴٫ روش کار۱۰۰
۳-۱۳٫ حيوانات آزمايشگاهي انتخاب شده براي تحقيق۱۰۱
۳-۱۳-۱٫ روش‌هاي نگهداري و پرورش موش کوچک آزمايشگاهي۱۰۱
۳-۱۳-۱-۱٫ نياز‌هاي محيطي موش کوچک آزمايشگاهي۱۰۱
۳-۱۳-۱-۲٫ بستر مناسب۱۰۳
۳-۱۳-۱-۳٫ رعايت اصول بهداشتي در نگهداري و پرورش موش کوچک آزمايشگاهي۱۰۳
۳-۱۳-۱-۴٫ تغذيه۱۰۴
۳-۱۴٫ اجراي الگوي زخم۱۰۵
۳-۱۵٫ تيمار موضعي ليپو پلي ساکاريد۱۰۷
۳-۱۶٫ آماده‌سازي ليزات بافت۱۰۹
۳-۱۷٫ تعيين ميزان نيتريک اکسيد در نمونه‌ي بافت ليز شده۱۱۰
۳-۱۷-۱٫ آماده‌سازي نمونه‌ها۱۱۰
۳-۱۷-۲٫ روش کار۱۱۰
۳-۱۸٫ تعيين ميزان هيدروژن پراکسيد براي نمونه‌هاي بافتي ليز شده۱۱۱
۳-۱۸-۱٫ آماده‌سازي نمونه‌ها۱۱۱
۳-۱۸-۲٫ منحني استاندارد H2O2111
3-18-3. مخلوط واکنش۱۱۲
۳-۱۹٫ اندازه‌گيري سطح آنزيم COX-2 براي نمونه‌هاي بافتي ليز شده۱۱۲
۳-۲۰٫ بررسي هيستوپاتولوژيکي بافت‌هاي زخم شده۱۱۳
۳-۲۱٫ آناليز آماري۱۱۳
فصل چهارم: نتايج
۴-۱٫ بررسي ميزان حيات سلول‌ها بدون تيمار LPS (بعد از ۲۴ و ۴۸ ساعت)۱۱۶
۴-۲٫ بررسي اثر LPS بر ميزان پروليفراسيون سلول‌هاي فيبروبلاست با استفاده از روش XTT117
4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فيبروبلاست در گروه اول (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست بلافاصله)۱۱۸
۴-۴٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فيبروبلاست در گروه دوم (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست با فاصله‌ي يک روز)۱۱۹
۴-۵٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان NO در گروه اول (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست بلافاصله) ۱۲۱
۴-۶٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان NO در گروه دوم (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست با فاصله‌ي يک روز)۱۲۲
۴-۷٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان H2O2 در گروه اول (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست بلافاصله)۱۲۳
۴-۸٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان H2O2 در گروه دوم (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست با فاصله‌ي يک روز)۱۲۴
۴-۹٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان COX-2 در گروه اول (بررسي اثر LPS بر فيبروبلاست بلافاصله)۱۲۵
۴-۱۰٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر ميزان COX-2 در گروه دوم (بررسي اثر LPS بر فيبرئبلاست با فاصله‌ي يک روز)۱۲۶
۴-۱۱٫ اثر LPS بر ميزان NO در زخم موش‌ها در روز‌هاي مختلف۱۲۷
۴-۱۲٫ اثر LPS بر ميزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌هاي مختلف۱۲۸
۴-۱۳٫ اثر LPS بر ميزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌هاي مختلف۱۲۹
۴-۱۵٫ نتايج نمونه‌هاي پاتولوژي۱۳۲
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
۵-۱٫ اثر LPS سالمونلا انتريکا بر تکثير سلول‌هاي فيبروبلاست۱۳۸
۵-۲٫ بررسي اثر LPS بر زخم ايجاد شده در شرايط invivo142
5-3. اثر LPS بر ميزان NO، H2O2 و COX-2 در شرايط invitro144
منابع۱۴۹
خلاصه انگليسي۱۶۲
فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول ۴-۱٫ نتايج حاصل از بررسي هاي پاتولوژيک لام هاي تهيه شده از بافت زخم۱۳۵
فهرست نمودارها
عنوانصفحه
نمودار ۴-۱٫ بررسي ميزان حيات سلول‌ها بدون تيمار LPS (بعد از ۲۴ ساعت)۱۱۶
نمودار ۴-۲٫ بررسي ميزان حيات سلول‌ها بدون تيمار LPS (بعد از ۴۸ ساعت)۱۱۷
نمودار ۴-۳٫ بررسي ميزان حيات سلولي براي گروه اول که تيمار بلافاصله LPS داشتند (۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بعد از تيمار)۱۱۸
نمودار ۴-۴٫ بررسي ميزان حيات سلولي براي گروه دوم که تيمار LPS براي آنها با فاصله‌ي يک روز بعد از کشت سلولي بود (۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بعد از تيمار)۱۱۹
نمودار ۴-۵٫ بررسي ميزان حيات سلولي براي گروه اول که تيمار بلافاصله LPS داشتند (۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بعد از تيمار)۱۲۰
نمودار ۴-۶٫ بررسي ميزان حيات سلولي براي گروه دوم که تيمار LPS براي آنها با فاصله‌ي يک روز بعد از کشت سلولي بود (۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بعد از تيمار)۱۲۰
نمودار ۴-۷٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت NO بلافاصله بعد از کشت سلولي (۷۲ و ۴۸ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۱
نمودار ۴-۸٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت NO با فاصله يک روز بعد از کشت سلولي (۴۸ و ۲۴ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۲
نمودار ۴-۹٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولي (۷۲ و ۴۸ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۳
نمودار ۴-۱۰٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت H2O2 با فاصله يک روز بعد از کشت سلولي (۴۸ و ۲۴ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۴
نمودار ۴-۱۱٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولي (۷۲ و ۴۸ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۵
نمودار ۴-۱۲٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت COX-2 با فاصله يک روز بعد از کشت سلولي (۴۸ و ۲۴ ساعت بعد از تيمار) ۱۲۶
نمودار ۴-۱۳٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت NO پس از ۱، ۲، ۳ و ۷ روز بعد از اجراي الگوي زخم ۱۲۷
نمودار ۴-۱۴٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت H2O2 پس از ۱، ۲، ۳ و ۷ روز بعد از اجراي الگوي زخم ۱۲۸
نمودار ۴-۱۵٫ بررسي ميزان اثر LPS بر فعاليت COX-2 پس از ۱، ۲، ۳ و ۷ روز بعد از اجراي الگوي زخم۱۲۹
فهرست اشكال
عنوانصفحه
شکل ۲-۱٫ ترکيب غشاي باکتري‌هاي گرم منفي غشاي سيتوپلاسمي‌يا غشاي داخلي، سلول باکتري را احاطه مي‌کند.۱۴
شکل ۲-۲٫ ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ي انشعاب اختصاصي O، مرکز داخلي و خارجي، ليپيد A مي‌باشد۱۵
شکل ۲-۳٫ ساختار LPS از نوع زبر.۱۶
شکل ۲-۴٫ ساختار ليپيد A در سالمونلا تيفي موريوم و اشريشيا کلي۱۹
شکل ۲-۵٫ سالمونلا انتريتيديس۲۸
شکل ۲-۶٫ اجزاي متقاطع التهاب۳۱
شکل ۲-۷٫ متابوليسم اسيد آراشيدونيک۳۳
شکل ۲-۸٫ مسير انتقال سيگنال توسط رسپتور‌هاي شبه تول۳۴
شکل ۲-۹٫ مسير بيوسنتز پروستانوئيد‌ها۳۶
شکل ۲-۱۰٫ تأثير COX-2 بر آنژيوژنز۴۰
شکل ۲-۱۱٫ اثر LPS بر توليد PGE241

شکل ۲-۱۲٫ نمايي از مکانيسم اثر LPS بر تحريک توليد COX-242
شکل ۲-۱۳٫ منابع توليد کننده ROS47
شکل ۲-۱۴٫ سيستم اکسيداسيون- احيا و تکثير سلولي۴۸
شکل ۲-۱۵٫ نقش ROS در چرخه‌ي سلولي۵۰
شکل ۲-۱۶٫ مراحل سنتز نيتريک اکسيد۵۲
شکل ۲-۱۷٫ رابطه‌ي بين NO، COX-2 و ROS با LPS57
شکل ۲-۱۸٫ فيبروبلاست۵۸
شكل ۲-۱۹٫ نمايي شماتيک از اندامک‌هاي داخلي فيبروبلاست۶۰
شکل ۲-۲۰٫ مراحل ترميم زخم پوستي۶۳
شکل ۲-۲۱٫ نگاهي کلي به فاز التهابي ترميم زخم۶۵
شکل ۲-۲۲٫ روز سوم زخم (فاز التهابي)۶۶
شکل ۲-۲۳٫ روز پنجم زخم (مرحله‌ي ري اپيتلياليزاسيون و رگ‌سازي)۶۶
شکل ۲-۲۴٫ کنترل مستقيم و غير مستقيم ري اپيتليزاسيون، آنژيوژنز و فعاليت فيبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها۷۲
شکل ۲-۲۵٫ اثر سلول‌هاي مختلف در ترميم زخم۷۳
شکل ۲-۲۶٫ مدل فرضي از نقش گونه‌هاي واکنشگر اکسيژن در مکانيسم سيگنال‌دهي فاکتور رشد اپيدرمي در سلول‌هاي اپيتليال۸۰
شکل ۲-۲۷٫ مدلي فرضي براي تنظيم ساخت کلاژن۸۴
شکل ۳-۱٫ احياي کلرومتريک XTT با آنزيم‌هاي سلولي۹۴
شکل ۳-۲٫ نگهداري از حيوانات آزمايشگاهي۱۰۱
شکل ۳-۳٫ نحوه قرارگيري موش‌هاي آزمايشگاهي در قفس‌هاي مخصوص۱۰۵
شکل ۳-۴٫ روز صفر پس از اجراي الگوي زخم۱۰۷
شکل ۳-۵٫ روزهاي مختلف پس از اجراي الگوي زخم۱۰۸
شکل ۳-۶٫ نحوه گرفتن بيوپسي از محل زخم و تقسيم‌بندي نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمايشگاه‌هاي بيوشيمي و پاتولوژي۱۰۹
شکل ۴-۱٫ عکس‌هاي حاصل از نمونه‌هاي پاتولوژيک۱۳۴
خلاصه فارسي
اندوتوکسين‌ها از عمده‌ترين فاکتور‌هاي ويرولانس باکتري‌هاي گرم منفي هستند که به دليل اثرات ايمونولوژيکي، پاتو فيزيولوژيکي و فارماکولوژيکي بر سلول‌هاي يوکاريوتي، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترميم زخم ممکن است به دليل نقص در مولکول‌هاي ميانجي متوقف شود. ليپو پلي ساکاريد (LPS) يکي از اصلي‌ترين محرک‌هاي توليد ميانجي‌هاي التهابي به شمار مي‌آيد. هدف اصلي اين تحقيق، بررسي اثر تجويز موضعي LPS سالمونلا انتريکا بر زخم تجربي ايجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنين اثر آن بر تکثير سلول‌هاي فيبروبلاست پوست مي‌باشد. نمونه‌گيري از بافت‌هاي پوستي مربوط به گروه‌هاي شاهد و تيمار طي روز‌هاي ۱، ۲، ۳ و ۷ بعد از ايجاد زخم، به منظور بررسي‌هاي بيوشيميايي و پاتولوژيکي انجام شد. ميزان حيات سلولي با استفاده از روش XTT براي سلول‌هاي فيبروبلاست صورت گرفت. زخم‌هاي تيمار شده با LPS (100?g) نسبت به گروه شاهد، افزايش ارتشاح سلول‌هاي التهابي به محل زخم و افزايشي جزئي در ميزان ضخامت لايه‌ي اپيتليوم نشان دادند. سنجش سيکلو اکسيژناز-۲ (COX-2)، هيدروژن پراکسيد (H2O2) و نيتريک اکسيد (NO) به منظور اثر احتمالي آنها در ترميم زخم مورد ارزيابي قرار گرفت. در سنجش‌هاي بيوشيميايي ميزان NO، COX-2، H2O2 افزايش يافت (P?0.001). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسي ميزان حيات سلول‌هاي فيبروبلاست تفاوت معنادار بين گروه‌هاي شاهد و تيمار مشاهده شد که البته اين تفاوت وابسته به دوز مصرفي LPS و مدت زمان انکوباسيون بود. نتايج نشان مي‌دهند که LPS با تحريک توليد ميانجي‌هاي التهابي، توانايي افزايش مرحله‌ي التهابي ترميم زخم را دارد. مطالعات گسترده‌تر با طراحي دوز‌هاي مختلف از LPS استرين‌هاي باکتريايي مختلف، فهم بهتري از مکانيسم اثر LPS در ترميم زخم در مدل حيواني نشان خواهد داد. به احتمال زياد اين يافته‌ها در توسعه‌ي روش‌هاي جديد براي درمان زخم‌ها ارزشمند خواهد بود.
واژگان کليدي: زخم، ليپو پلي ساکاريد سالمونلا انتريکا، التهاب، نيتريک اکسيد، سيکلو اکسيژناز-۲، هيدروژن پر اکسيد، فيبروبلاست
فصل اول
كليات
۱-۱٫ بيان مسئله
سالمونلا انتريکا از دسته‌ي باکتري‌هاي گرم منفي بي‌هوازي اختياري داخل سلولي است که سالانه باعث ۱٫۳ ميليارد مورد بيماري در جهان مي‌شود. از ميان ۶ زير گونه‌ي سالمونلا که بر اساس تفاوت در فلاژل، کربوهيدرات و ليپوپلي ساکاريد دسته‌بندي شده‌اند، بيش از ۲۵۰۰ سرووار مربوط به سالمونلا انتريکا شناخته شده است. سالمونلا مي‌تواند طيف وسيعي از سلول‌ها مثل دندريتيک سل‌ها، ماکروفاژها، هپاتوسيت‌ها، نوتروفيل‌ها، کولونوسيت‌ها و سلول‌هاي اپي‌تليال را مورد حمله قرار دهد. LPS سالمونلا از محرک‌هاي قوي پاسخ التهابي در ماکروفاژ‌ها محسوب مي‌شود.
التهاب پوستي و نکروز هموراژيک که به توسط ليپوپلي ساکاريد و ليپيد A باکتري‌ها ايجاد مي‌شوند، در موش مورد مطالعه قرار گرفته است. با تزريق داخل پوستي LPS S-form و ليپيد A سالمونلا تيفي موريوم به موش ddy، بعد از ۱۲ ساعت ميزان نفوذپذيري رگها در آن منطقه تغيير مي‌کند و باعث ادم مي‌شود و به دنبال آن بعد از ۲۴ تا ۷۲ ساعت منجر به نکروز هموراژيک مي‌شود. القاي التهاب پوستي توسط LPS و ليپيد A به ترتيب از بيشترين تاثير تا کمترين تاثير بدين صورت هستند:
Re-form LPS > Rc-form LPS > lipid A > Ra-form LPS > S-form LPS
ادم حاصل از تزريق LPS در پاسخ به فعاليت کمپلمان ايجاد مي‌شود در حاليکه واکنش‌هاي هموراژيک به فعاليت سلول‌هاي هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌هاي اندوتليال درون رگي مربوط مي‌شوند. جزيره‌ي بيماريزايي ۲ سالمونلا (SPI2) براي فرار از ماکروفاژ‌ها و ايجاد عفونت سيستميک در موش‌ها لازم مي‌باشد. سالمونلا مي‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ي SPI-2 شود و به دنبال القاي توليد PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزايش بيان COX-2 (سيکلواکسيژناز-۲) شود. سايتوکاين‌ها و ايکوزانوئيدهايي چون پروستاگلاندين‌ها و لوکوترين‌ها در نحوه‌ي عملکرد ماکروفاژ‌ها تاثير مي‌گذارند. پروستاگلاندين‌ها (PGs) که در انواع مختلفي از سلول‌ها ساخته مي‌شوند از جمله ميانجي‌هاي مهم التهاب و پاسخ ايمني محسوب مي‌شوند. مرحله‌ي محدود کننده‌ي سرعت در سنتز PGs توسط COX کاتاليز مي‌شود. COX-2 در انواع کمتري از سلول‌ها بيان مي‌شود ولي به شدت با محرک‌هاي مختلفي مثل ميتوژن‌ها، سايتوکاين‌ها، هورمون‌ها و انکوژن‌ها القا مي‌شود، همچنين ليپو پلي ساکاريد‌ها در القاي بيان COX-2 در مونوسيت‌ها و ماکروفاژ‌ها سهيم هستند که اين نوع از القا که با LPS ايجاد مي‌شود، توسط مسير سيگنال‌دهي انتقالي پروتئين کيناز تحريک شده با ميتوژن (MAPK) تنظيم مي‌شود. پروتئين SpiC کد شده توسط SPI-2 بوسيله‌ي سيستم ترشحي تيپ III به سيتوزول ماکروفاژ‌هايي که با سالمونلا آلوده شده‌اند منتقل مي‌شود و با پروتئين‌هاي ميزبان همچون TassC و Hook3 که در تردد سلولي نقش دارند وارد واکنش مي‌شود. همچنين در مطالعاتي نقش SPI-2 در مهار فيوژن SCV (واکوئل‌هاي حاوي سالمونلا) با وزيکول‌هاي مسير اندوسيتيک مثل وزيکول‌هاي حاوي نيتريک اکسايد سنتتاز القايي (iNOS) و NADPH اکسيداز به اثبات رسيده است.
هنگامي‌که سالمونلا انتريکا سلول‌هاي پستانداران را مورد هجوم قرار مي‌دهد سيگنال‌هايي را فعال مي‌کند و منجر به افزايش بيان ميانجي‌هاي التهابي مي‌شوند. يکي از اين ميانجي‌ها، نيتريک اکسيد (NO) است که توليد آن تحت کنترل آنزيم نيتريک اکسيد سنتتاز القايي(iNOS) مي‌باشد. اين آنزيم در پوست در کراتينوسيت‌ها، فيبروبلاست‌ها، سلول‌هاي لانگرهانس و اندوتليال‌ها القا مي‌شود. تيپ وحشي سالمونلا مي‌تواند هم ميزان پروتئين iNOS و هم ميزان mRNA مربوطه را در سلول‌هاي ماکروفاژ موش افزايش دهد. استرين‌هاي موتانت سالمونلا که فاقد SPI-1 هستند سيستم ترشحي تيپ III آنها کد نمي‌شود و همچنين استرين‌هايي که فاقد مولکول‌هاي تهاجمي ‌SipB, SipC, SipD هستند نمي‌توانند باعث القاي iNOS شوند. نشت پلاسما در پوست موش به کمک جمع‌آوري موضعي pontamine sky blue در محل تزريق LPS اندازه‌گيري مي‌شود. اين مطالعات نشان مي‌دهند که بالا رفتن ميزان نفوذپذيري رگ‌ها بوسيله‌ي LPS، به ميانجي‌گري NO حاصل از iNOS، ايکوزانوئيد‌ها، هيستامين و TNF-? صورت مي‌گيرد. تولرانس ايجاد شده بر عليه تغييرات نفوذپذيري که توسط LPS در رگ‌ها رخ مي‌دهد با القاي iNOS ميانجي‌گري مي‌شود نه با افزايش رهاسازي کورتيکواستروئيد‌هاي اندوژنوز. نشت پلاسما در پوست بوسيله‌ي LPS حداکثر تا ۲ ساعت رخ مي‌دهد. تزريق زير جلدي LPS هم در موش‌هاي تيپ وحشي و هم در موش‌هاي فاقد iNOS مي‌تواند باعث افزايش نشت پلاسما شود به طوريکه اثر LPS در موش‌هاي فاقد iNOS نسبت به تيپ وحشي کمتر است. اين نشان مي‌دهد که LPS در افزايش ميزان پروتئين iNOS در پوست رت نقش دارد. نتايج نشان مي‌دهند که افزايش نفوذپذيري رگها توسط LPS در موش‌هاي وحشي بطور عمده وابسته به توليد NO به وسيله‌ي iNOS مي‌باشد ولي در موش‌هاي فاقد iNOS،LPS با مکانيسمي‌مستقل از iNOS ميزان نفوذپذيري رگها را تغيير مي‌دهد که اين کار را به واسطه‌ي ميانجي‌هايي مثل ايکوزانوئيد‌ها، هيستامين و TNF-? انجام مي‌دهد. ايکوزانوئيد‌ها که به طور عمده توسط COX-2 توليد مي‌شوند، نقش خود را در نشت پلاسما در موش‌هاي فاقد iNOS و موش‌هاي وحشي ايفا مي‌کنند. همچنين با مطالعاتي که روي ديفن هيدرامين، هيستامين و آنتي‌بادي ضد TNF-? انجام گرفته است، نقش آنها در افزايش نفوذپذيري رگها آشکار شده است. دليل انتخاب COX-2 و iNOS در اين تحقيق به دليل القا پذير بودن آنها مي‌باشد، در ضمن اين دو فاکتور القايي اثر سينرژيسمي‌بر روي يکديگر دارند و افزايش يکي از آنها باعث افزايش ديگري و همينطور کاهش يکي از آنها باعث کاهش ديگري مي‌شود.
فرآيند التيام زخم جلدي مستلزم واکنش بين سلول‌هاي موجود در درم و اپيدرم و رهاسازي ميانجي‌هاي شيميايي از سلول‌هاي التهاب‌آور، فيبروبلاست‌ها و کراتينوسيت‌ها مي‌باشد. اين فرآيند پيچيده شامل مهاجرت سلول‌ها، تکثير سلول‌ها، حذف ماتريکس خارج سلولي، آنژيوژنز و ترميم مي‌باشد. امروزه زخم‌هاي مزمن يا زخم‌هايي که از توانايي ترميم پائيني برخوردارند، از مشکلات مهم باليني به شمار مي‌روند و از آنجايي که در جوامع امروزي شيوع اين نوع زخم‌ها با افزايش رخداد بيماري‌هايي مثل چاقي، ديابت مليتوس و زخم بستر به طور پيشرونده‌اي بالا مي‌رود، لذا تلاش‌هاي زيادي براي معرفي داروهاي جديد با منشاء گياهي يا شيميائي که فرآيند ترميم را تسريع مي‌بخشند، صورت مي‌گيرد. بهبود زخم در برخي از بيماري‌ها و اختلالات مزمن به يکي از چالش‌هاي علم پزشکي تبديل شده است. به همين دليل ترکيبات جديدي که به منظور تسريع التيام زخم تهيه مي‌گردند، مورد استقبال واقع مي‌شوند.
اکسيدانت‌ها با سيگنال‌دهي و فراهم آوردن سيستم دفاعي بر عليه ميکروارگانيسم‌ها نقش مهمي‌در التيام زخم دارند. همچنين با تکيه بر شواهدي که از مطالعات انساني و حيواني بدست آمده، مي‌توان اثر سودمند NO در التيام زخم‌ها را بيان کرد که اين موضوع به دليل اثري است که NO در آنژيوژنز، التهاب، گشاد کردن رگ‌ها، تکثير سلولي، تعمير، ايمني، تمايز سلولي و آپوپتوز مي‌گذارد (۸ و ۱۲). تحقيقاتي که در اين زمينه انجام گرفته‌اند نشان مي‌دهند که ژن درماني NOS و SODبه موجب افزايش NO و کاهش سوپراکسيد، در تسريع التيام زخم‌هاي مقاوم به خصوص زخم ديابتي نوع ۱ نقش دارند (۷ و ۱۳). همچنين نقش COX-2 در تکثير و تمايز کراتينوسيت‌ها به دنبال خراشيدگي جزئي در پوست به اثبات رسيده است.
۱-۲٫ ضروريت انجام تحقيق
بر اساس بررسي‌هاي انجام شده در سطح کتابخانه‌اي و اينترنتي، اين موضوع براي اولين بار در کشور مورد بررسي قرار مي‌گيرد. از دلايل انتخاب اين موضوع مي‌توان به توجه کمي ‌که به پوست از لحاظ ميکروبيولوژي شده است اشاره کرد و همانطور که مي‌دانيم باکتري‌هاي گرم منفي همچون سالمونلا با سرووار‌هاي متعددي که دارند در محيط پيرامون ما به وفور حضور دارند و باعث بيماريزايي مي‌شوند، پس احتمال اينکه از طريق زخم هم وارد پوست شوند وجود دارد، از سويي ديگر در ايران ميزان استفاده از لوازم آرايشي نيز بسيار بالاست و امروزه زخم‌هاي مزمن يا زخم‌هايي که از توانايي ترميم پائيني برخوردارند، از مشکلات مهم باليني به شمار مي‌روند. با توجه به اين که آنزيم‌هاي iNOS و COX-2 القاپذير هستند و از دسته عوامل مهم در التهاب، ايمني‌زايي، تکثير سلولي، تعمير، آنژيوژنز، تمايز سلولي و آپوپتوز مي‌باشند سنجش اين آنزيم‌ها را انتخاب نموده‌ايم. در اين تحقيق سعي مي‌شود با تحريک اين فاکتور‌ها توسط ليپو پلي ساکاريد باکتري‌هاي گرم منفي در سلول‌هاي پوست، ميزان تغيير فاکتور‌هاي التهابي و همچنين اثر احتمالي آنها در التيام زخم را مورد بررسي قرار دهيم.
۱-۳٫ اهداف پژوهش
۱٫ تعيين ميزان فعاليت COX-2 و NO و H2O2 در پوست سالم موش
۲٫ تعيين ميزان تغيير فعاليت آنزيم COX-2 پس از اثر دادن ليپوپلي ساکاريد بر زخم پوست موش
۳٫ تعيين ميزان تغيير NO پس از اثر دادن ليپوپلي ساکاريد بر زخم پوست موش
۴٫ تعيين ميزان تغيير H2O2 پس از اثر دادن ليپو پلي ساکاريد بر زخم پوست موش
۱-۴٫ سئوالات و فرضيه‌ها:
۱٫ با اثر دادن ليپوپلي ساکاريد بر روي زخم پوست موش ميزان فعاليت آنزيم COX-2 تغيير مي‌کند.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

۲٫ با اثر دادن ليپوپلي ساکاريد بر روي زخم پوست موش ميزان فعاليت NO تغيير مي‌کند.
۳٫ با اثر دادن ليپوپلي ساکاريد بر روي زخم پوست موش ميزان فعاليت H2O2 تغيير مي‌کند
۴٫ تيمار ليپوپلي ساکاريد بر روي زخم پوست بر تغييرات ترميم و التيام زخم اثر دارد.

فصل دوم
مروري بر متون گذشته
۲-۱٫ ليپوپلي‌ساكاريد
در سال ۱۹۹۱،Yoshihito Ishikawa و همکارانش التهاب پوستي و نکروز هموراژيک که به توسط ليپوپلي ساکاريد و ليپيد A باکتري‌ها ايجاد مي‌شوند را در موش مورد مطالعه قرار دادند و به اين نتيجه رسيدند که ادم حاصل از تزريق LPS در پاسخ به فعاليت کمپلمان ايجاد مي‌شود در حاليکه واکنش‌هاي هموراژيک به فعاليت سلول‌هاي هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌هاي اندوتليال درون رگي مربوط مي‌شوند.
در سال ۱۹۹۷، Umezava Kei و همکارانش با روش RT-PCR و روش ايمونوهيستوشيمي‌با آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي iNOS افزايش ميزان mRNA iNOS در بافت‌هاي آلوده شده با سالمونلا را گزارش کردند.
در سال ۱۹۹۷، Emiko Fujii و همکارانش نقش نيتريک اکسايد، پروستاگلاندين و تيروزين کيناز را در فعاليت فاکتور رشد اندوتليال رگ(VGEF) در پوست موش را مورد بررسي قرار دادند و به اين نتيجه رسيدند که اين عوامل در افزايش بيان VGEF و افزايش نفوذپذيري رگ‌ها و نشت پلاسما مؤثر هستند.
در سال ۲۰۰۰، Hiroysau Ishida و همکارانش طبق مطالعاتي که درباره‌ي تأثير LPS و آنالوگ آن(OnO-4007) روي تغيير نفوذپذيري رگ‌ها در پوست موش انجام دادند به اين نتيجه رسيدند که LPS مي‌تواند ۶۰ دقيقه بعد از تزريق، ميزان نشت پلاسما را بالا ببرد ولي آنالوگ آن فقط در دوز‌هاي بالاتر مي‌تواند اثر مشابه را بگذارد که اين به دليل تاثير ميانجي‌ها و رسپتور‌هاي متفاوت بر روي آنهاست.
در سال ۲۰۰۰، Andres Vazquez-Torres و همکارانش با بررسي رابطه‌ي بين ماکروفاژ‌ها و سالمونلا در کشت بافت به اين نتيجه رسيدند که iNOS القا مي‌شود.
در سال ۲۰۰۴،Kei-ichi Uchiya و Toshiaka Nikai با بررسي جزيره‌ي بيماريزايي ۲ در سالمونلا به اين نتيجه رسيدند که سالمونلا مي‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ي SPI-2 شود و به دنبال القاي توليد PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزايش بيان COX-2 شود.
در سال ۲۰۰۰، Bobby J.Cherayil و همکارانش آناليز القاي بيان iNOS در ماکروفاژ‌ها توسط سالمونلا انجام دادند و به اين نتيجه رسيدند که تيپ وحشي سالمونلا مي‌تواند هم ميزان پروتئين iNOS و هم ميزان mRNA مربوطه را در سلول‌هاي ماکروفاژ موش افزايش دهد. ميانجي نهايي القاي iNOS، پروتئين افکتوري است که از طريق سيستم ترشحي تيپ III و در مسيري وابسته به SipB، SipC و SipD به داخل ماکروفاژ‌ها منتقل مي‌شود.
در سال ۲۰۰۰، Emiko Fujii و همکارانش طي مطالعاتي که در مورد تزريق زير جلدي و يا درون پوستي LPS در پوست موش و رت انجام دادند به اين نتيجه رسيدند که افزايش نفوذپذيري رگها توسط LPS در موش‌هاي وحشي بطور عمده وابسته به توليد NO به وسيله‌ي iNOS مي‌باشد ولي در موش‌هاي فاقد iNOS، LPS با مکانيسمي‌مستقل از iNOS ميزان نفوذپذيري رگها را تغيير مي‌دهد که اين کار را به واسطه‌ي ميانجي‌هايي مثل ايکوزانوئيد‌ها، هيستامين و TNF-?انجام مي‌دهد.
در سال ۲۰۰۱، Kaoru Irie و همکارانش طي مطالعه‌اي که روي اثر ضد التهابي عوامل افزايش دهنده‌ي CAMP در مدل موشي که نفوذپذيري درون رگي آن با ليپوپلي ساکاريد تغيير يافته بود انجام دادند به اين نتيجه رسيدند که عوامل افزايش دهنده‌ي CAMP با جلوگيري از بيان TNF-? به واسطه‌ي LPS، در کاهش ميزان نفوذپذيري رگها اثر مي‌گذارند. با تزريق زير جلدي LPS به موش، پس از يک ساعت ميزان TNF-? بالا مي‌رود که در اين زمان CAMP مي‌تواند توليد آن را مهار کند و در کاهش نفوذپذيري رگ‌ها اثر بگذارد. ولي در مقابل، IL-1 که به واسطه‌ي LPS افزايش يافته است، تحت‌تاثير هيچکدام از عوامل CAMP قرار نمي‌گيرد.
در سال ۲۰۱۱، حسين رستگار، حميدرضا احمدي آشتياني و همکاران با بررسي اثر LPS سالمونلا انتريتيديس بر سلول‌هاي سرطاني کبدي، به اين نتيجه رسيدند که افزودن LPS به محيطي که COX-2 دارد نه تنها LPS باعث بيان COX-2 نمي‌شود بلکه به مهارکننده‌ي COX-2 کمک مي‌کند تا فعاليت COX-2 را کاهش دهد. از مهارکننده‌هاي COX-2 مي‌توان در درمان سرطان استفاده کرد و با توجه به اينکه LPS در اين مجموعه کمک‌رساني مي‌کند در آينده مي‌توان در طراحي دارو‌هاي ضد سرطاني از آن استفاده کرد.
۲-۱-۱٫ تاريخچه‌ ليپو پلي ساکاريد
تب يکي از ابتدايي‌ترين يافته‌هاي علم پزشکي گزارش شده است. در سال‌هاي گذشته فرض محققين بر اين بوده که تحريک کننده‌هاي تب وجود فيزيکي داشته و پيروژن ناميده مي‌شدند که بر آمده از ريشه يوناني pyr به معني آتش بود. با پيشرفت علوم گفته شد که تب تظاهري از بيماري يا دفاع ميزبان عليه بيماري است. آلبرشت ون‌هالر۱ پيشوايي در زمينه‌ي ليپو پلي ساکاريد (اندوتوکسين) بود که نشان داد بعد از تزريق داخل وريدي اندوکسين، بافت تجزيه شده توانايي تحريک تب در حيوانات را دارد. در سال ۱۹۸۲ ميلادي ريچارد فيفر۲ گزارش کرد که ويبريو کلرا داراي توکسيني است که بخشي جدايي‌ناپذير از بدنه‌ي باکتري است.
اندوتوکسين براي اولين بار در سال ۱۹۳۲ ميلادي توسط آندره بوئيوين۳ و ليديا مسروبنو۴ و بر اساس روش تري کلرو استيک اسيد (TCA) خالص‌سازي شد. والتر مورگان۵ و والتر گوبل۶ با استفاده از حلال‌هاي ارگانيک و آب موفق به تخليص اندوتوکسين شدند. يافته‌هاي هر دو گروه نشان مي‌داد که اندوتوکسين ترکيبي از ليپيد و پلي ساکاريد و همچنين ميزان کمي‌از پروتئين‌هاي مرتبط بود. با اينکه اين ترکيب خام دستاوردي عظيم در درک ما از LPS بود، تصور روش‌هاي جايگزين ديگر براي تخليص منجر به خالص‌سازي محصول با درجه‌ي بالا و درک بهتر مولکول مي‌شد. اتو وستفال۷ و اتو لودريتز۸ دانشمنداني بودند که موفق به تخليص با درجه‌ي بالاتر و اندوتوکسيني با فعاليت بيولوژيکي از باکتري‌هاي گرم منفي مختلف با روش استخراج آب- فنول داغ۹ شدند. محصول آنها فاقد پروتئين و فقط حاوي کربوهيدرات، اسيد‌هاي چرب و فسفر بود. آنها اولين کساني بودند که کلمه‌ي ليپو پلي ساکاريد را براي توضيح اندوتوکسين به کار بردند، اگرچه اين کلمه در زمان جامعه‌ي دانشمندي آنها مورد قبول قرار نگرفته بود. همچنين مطالعات ديگري در رابطه با اثبات حضور LPS در باکتري‌هاي گرم منفي بيماريزا و غير بيماريزا توسط وستفال و لودريتز صورت گرفت. در حال حاضر مي‌دانيم که LPS در لايه‌ي بيروني غشاي خارجي باکتري‌هاي گرم منفي قرار گرفته است و موتانت‌هايي که داراي نقص در مراحل اوليه‌ي بيوسنتز LPS هستند زنده نمي‌مانند.
ليپو پلي ساکاريد باکتريايي از اجزاي اصلي لايه‌ي بيروني غشاي خارجي باکتري‌هاي گرم منفي است که در علم پزشکي اغلب به دليل دارا بودن ويژگي‌هاي تنظيمي ‌ايمني مورد استقبال قرار مي‌گيرد. بطوريکه در مقادير کم مي‌توانند مفيد واقع شوند ولي در مقادير زياد ممکن است باعث شوک اندوتوکسيک شوند. ليپو پلي ساکاريد (LPS)10 از اجزاي اصلي آمفي فيليک در غشاي بيروني باکتري‌هاي گرم منفي است اما در طول تقسيم سلولي و انواع پروسه‌هاي بيوشيميايي و همچنين با در دست گرفتن سيستم ايمني ميزبان مي‌تواند در محيط رهاسازي شود. در واقع LPS به دليل توانايي تحريک انواع اثرات بيولوژيکي در پستانداران و همچنين در توليد سايتوکاين‌هاي پيش التهابي همچون فاکتور نکروز دهنده تومور-? (TNF-?) و اينترلوکين‌ها، به نام اندوتوکسين خوانده مي‌شود. توليد اين ميانجي‌ها در غلظت‌هاي پايين اندوتوکسين ممکن است منجر به اثرات بيولوژيکي مفيد شوند ولي در غلظت‌هاي بالاتر، رهاسازي سايتوکاين‌ها مي‌تواند منجر به سميت خود بدن و در نتيجه ايجاد سندروم شوک شود. LPS شامل يک بخش قندي با شاخه‌هايي با اندازه‌هاي مختلف از پلي ساکاريد (آنتي‌ژن O) تا اليگوساکاريد که اين وابسته به گونه‌هاي باکتريايي و يا موتانت‌هاي باکتريايي (فرم صاف LPS تا فرم زبر LPS) است و به صورت کوالان به قسمت هيدروفوبيک LPS يعني ليپيد A متصل مي‌شود که آن هم در اتصال مولکول LPS به غشا نقش دارد (۱۸).
شکل ۲-۱٫ ترکيب غشاي باکتري‌هاي گرم منفي غشاي سيتوپلاسمي‌يا غشاي داخلي، سلول باکتري را احاطه مي‌کند.
پري پلاسم که داراي پپتيدوگليکان مي‌باشد توسط غشاي خارجي احاطه مي‌شود. ليپو پلي ساکاريد در لايه‌ي بيروني غشاي خارجي قرار دارد و حاوي ۳ جزء متمايز ليپيد A، مرکز اليگوساکاريدي و آنتي ژن O است. مرکز اليگوساکاريدي شامل يک تک قند به نام ۲- کتو-۲- دئوکسي اوکتونات (KDO) است (۱۸).
۲-۱-۲٫ ساختار ليپو پلي ساکاريد
دسترسي به LPS خالص امکان مطالعه‌ي اجزاي آن را به صورت جداگانه فراهم آورده است. خانواده‌ي انتروباکترياسه (باکتري‌هاي بيماريزا و غير بيماريزاي گوارشي) از جمله سالمونلا و اشريشيا از نخستين باکتري‌هايي بودند که LPS آنها به صورت شيميايي مورد بررسي قرار گرفت. مورفولوژي کلوني همه‌ي تيپ‌هاي وحشي استرين‌هاي اين باکتري‌ها شبيه هم‌اند که کامل و صاف هستند (به جز برخي از موتانت‌ها که کلوني‌هاي زبر با لبه‌هاي نامنظم دارند). پيشنهاد لودريتز بعد از مطالعه‌ي صد‌ها LPS انتريک اين بود که تمام اندوتوکسين‌ها ترکيبي از ۳ اجزاي عمومي‌هستند: انشعاب اختصاصي O، مرکز اليگوساکاريد و ليپيد A.
شکل ۲-۲٫ ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ي انشعاب اختصاصي O، مرکز داخلي و خارجي، ليپيد A مي‌باشد (۱۸).
(KDO 2- کتو-۲- دئوکسي اوکتونات: ؛Hep:هپتوز ؛Hexهگزوز: )
همان طور که ذکر شد LPS از ۳ ناحيه که به صورت کوالانت به هم متصلند تشکيل شده است. ناحيه ليپيد A يا اندوتوکسين A در غشاي خارجي مانند لنگري هيدروفوبيک عمل مي‌کند و داراي فعاليت توکسيني است. ناحيه هسته، اليگوساکاريدي فسفريله شده است و در برابر آنتي‌بيوتيک‌ها در غشا خارجي به عنوان سد عمل مي‌کند. ناحيه پليمري آنتي‌ژن O اليگوساکاريدي ايمونوژنيک است که از واحد‌هاي قندي تکرار شونده تشکيل شده است. اين واحد‌ها در گونه‌هاي مختلف و نيز از سويه‌اي به سويه‌ي ديگر متفاوتند. ناحيه‌ي ليپيد A در تمام باکتري‌هاي گرم منفي يکسان است يا تفاوت اندکي دارد. ناحيه دروني هسته در محدوده وسيعي از گونه‌هاي باکتريايي يکسان است و در مواردي درجات محدودي از تمايز را نشان مي‌دهد. اما ساختمان آنتي‌ژن O به طور قابل توجهي در باکتري‌هاي گرم منفي متفاوت است که پايه مهمي‌ براي تشخيص و تعيين گونه و سويه‌هاي باکتري‌هاي گرم منفي است. کلني باکتري‌هاي گرم منفي بر حسب شکل ظاهري خود به دو فرم زبر (R)11 و نرم (S)12 تقسيم مي‌شوند. در فرم S مولکول LPS به طور کامل بروز مي‌کند در صورتي که در فرم R مولکول LPS فاقد آنتي‌ژن O به طور کامل است (۶).
شکل ۲-۳٫ ساختار LPS از نوع زبر. پلي ساکاريد اختصاصي O شامل تعداد مختلفي از واحد‌هاي تکراري پنتا ساکاريد است. Hep: L- گليسرو- D- مانو- هپتوز، Gal: گالاکتوز، Glc: گلوکز، GlcN: گلوکزآمين، GlcNAc: N- استيل گلوکزآمين، Kdo: 3- دئوکسي- D- مانو- اوکت-۲- اولوسونيک اسيد،L-Ara4N: 4- آمينو-۴-دئوکسي-L – آرابينوز (۶).
۲-۱-۲-۱٫ آنتي‌ژن O (شاخه‌ي اختصاصي O):
مطالعات نشان مي‌دهند که آنتي‌ژن- O يک پلي ساکاريد پيچيده است که حاوي واحد‌هاي تکراري ۵ تا ۸ مونوساکاريد (گالاکتوز، رامنوز، مانوز و آبکوز در سالمونلا تيفي موريوم) مي‌باشد. گونه‌هاي مختلف سالمونلا داراي انواع مختلفي از آنتي‌ژن‌هاي O هستند و آنتي سرمي ‌که ضد هر گونه از آن ايجاد مي‌شود هيچ گونه واکنش متقاطعي با گونه‌ي ديگر ندارد. اين يافته‌ها در طبقه‌بندي باکتري‌ها به سروتيپ‌ها که توسط کافمن، لودريتز و وستفال در سال ۱۹۶۰ ميلادي پايه‌گذاري شد مؤثر بود. آنتي‌ژن O داراي فعاليت‌هاي بيولوژيکي متعددي همچون عرضه رسپتور براي باکتريوفاژ‌ها، تنظيم فعاليت مسير آلترناتيو کمپلمان و مهار اتصال کمپلکس اتصال شونده به غشا به غشاي خارجي باکتري است (۷۷ و ۶۴).
۲-۱-۲-۲٫ اليگوساکاريد مرکزي
در سال‌هاي بعد مشخص شد که همه‌ي باکتري‌هاي گرم منفي داراي آنتي‌ژن O نيستند. اين دسته از باکتري‌ها را با نام زبر (R) مي‌خواندند چون کلوني‌هايي ناقص و ضخيم در روي آگار جامد تشکيل مي‌دادند و در سالين اتوآگلوتيناسيون نشان مي‌دادند. مطالعات در محور اليگوساکاريد مرکزي با شناسايي موتانت‌هاي سالمونلا مينسوتا۱۳ و سالمونلا تيفي موريوم۱۴ فراهم شد. موتانت‌هاي زبري که تمام قسمت مرکزي را سنتز کنند ولي فاقد آنتي‌ژن O باشند را با نام Ra مي‌شناسند و آنهايي که فاقد قند مرکزي باشند با نام Rb و موتانت‌هايي که داراي کوتاهترين قسمت مرکزي باشند را با نام Re مي‌خوانند. اگر چه ناحيه‌ي مرکزي در ميان گونه‌هاي باکتريايي فرق مي‌کند ولي همه‌ي اين نواحي‌ها داراي قند غير معمول ۲- کتو-۳ – دئوکسي اوکتونات (KDO) هستند. از ديگر رزيدو‌هاي آن مي‌توان به هپتوز، گلوکز، گالاکتوز و N- استيل گلوکز آمين اشاره کرد. حداقل ميزان لازم براي بقاي سلول، يک تک مولکول KDO مي‌باشد که در LPS سالمونلا و اشريشيا کلي نوع Re حضور دارد. با توجه به شديدترين موتانت يعني Re مي‌توان استنباط کرد که KDO بايد مستقيماً به ليپيد A متصل شده باشد. در مورد فعاليت بيولوژيکي ناحيه‌ي مرکزي بيروني LPS يافته‌هاي زيادي وجود ندارد اما اعتقاد بر اين است که هر دو مرکز بيروني و دروني حامل اپي توپ‌هايي براي آنتي‌بادي هستند.
۲-۱-۲-۳٫ ليپيد A
وستفال و لودريتز با کشف ليپيد A اعتبار زيادي به دست آوردند. آنها در سال ۱۹۵۴ ميلادي ساختار ليپيدي محلول در پيريدين و کلروفرم را از LPS و توسط تيمار آن با HCl به مدت ۳۰ دقيقه و در دماي بالا خالص‌سازي کردند. تعيين ساختار ليپيد استخراج شده نسبت به ناحيه‌ي مرکزي و آنتي‌ژن O مشکل بود، تا زماني که تاکاياما ساختار کامل و صحيح ليپيد A را در سال ۱۹۸۳ بيان کرد. در حال حاضر مي‌دانيم که ليپيد A داراي يک ستون دي گلوکز آميني است که حاوي اتصالات ?(۱-۶) مي‌باشد. دو گروه فسفات در جايگاه ۱ و ۴ به اين ستون وصل مي‌شوند. اين فسفات‌ها اغلب با گروه‌هاي قطبي مثل ۴- آميتو- ۴- دئوکسي-L- آرابينوز و يا اتانول آمين تغيير مي‌يابند که هر دو با تيمار اسيد ملايم حذف مي‌شوند تا تخليص و مطالعه LPS صورت گيرد. براي اولين بار ترکيب اسيد چرب ليپيد A در اشريشيا کلي توضيح داده شد که ۶ انشعاب اسيد چرب به ستون ليپيد A وصل مي‌شوند، ۲ تا از طريق اتصالات آميدي و ۴ تا از طريق اتصالات استري مي‌باشد. اسيد‌هاي چربي که اتصال آميدي دارند منحصراً ۳- هيدروکسي مريستات هستند اما اسيد‌هاي چربي که اتصال استري دارند داراي امتداد‌هاي متنوعي مثل مريستات، لائورات و يا پالميرات هستند. بعد‌ها کشف شد که ۲ تا از ۴ اسيد چربي که اتصال استري دارند مستقيماً به ستون ليپيد A وصل نمي‌شوند ولي در واقع به گروه‌هاي ۳- هيدروکسيل در اسيد‌هاي چرب با اتصالات تک استري و تک آميدي اتصال مي‌يابند (۹۹و ۱۰۱و ۷۸ و ۵۲).

دسته بندی : 22

پاسخ دهید